文献解读｜TCF4依赖的基因调控网络使黑色素瘤对免疫治疗产生耐药性

原创 TUE 伯豪生物

期刊：Cell

影响因子：64.5

主要技术：scRNA-seq、ST

导语

为了更好地理解免疫检查点阻断(ICB)的内在抗性，建立了治疗初期黑色素瘤生态系统的细胞结构的全面视图，并研究了其在ICB下的进化。利用单细胞、空间多组学分析发现肿瘤微环境促进了复杂黑色素瘤转录组学景观的出现。黑色素瘤细胞具有间充质样（mesenchymal-like，MES）状态，这是一种已知对靶向治疗产生耐药性的细胞，在早期治疗活检中，对ICB无反应的黑色素瘤细胞显著富集。TCF4是MES信号的主要调控因子，也是黑素细胞和抗原呈递转录程序的抑制因子。通过基因或药物靶向TCF4，使用溴结构域抑制剂，增加MES细胞对ICB和靶向治疗的免疫原性和敏感性。因此，发现了一个依赖TCF4的调控网络，该网络协调了多个转录程序，并有助于黑色素瘤对靶向治疗和ICB的耐药性。

研究技术

scRNA-seq、ST

研究结果

1、ICB下转移性黑色素瘤（MM）的单细胞图谱，描绘治疗初期黑色素瘤转录组学景观

为了查明MM中免疫逃逸的可能机制，对皮肤、皮下或淋巴结转移灶进行了活组织检查(BT和早期治疗；然后进行scRNA-seq、多重免疫组化(mIHC)和RNA荧光原位杂交。超过59,000个单细胞通过了质量控制，鉴定出了7种黑色素瘤细胞状态。在人类病变中发现了6个与小鼠细胞状态重叠的簇——黑素细胞(MEL)、间充质样(MES)、抗原呈递、神经嵴样、应激(缺氧)和应激(p53反应)——这些被称为小鼠RNA加工。在之前描述的标记基因中，NGFR在神经嵴样状态下被鉴定，VEGFA在应激(缺氧反应)细胞中被鉴定，COL5A1在MES细胞中被鉴定。HLA I类和II类，以及其他参与APM的基因，如TAP1、B2M和NLRC5，被鉴定为抗原呈递细胞的鉴别标记。这些细胞也表达了典型的干扰刺激基因程序，并使人想起在其他癌症类型中发现的癌细胞。使用推断的CNV图谱将所有恶性细胞归类为拷贝数变异（CNV）基因组簇。冲积图显示，除了来自患者特异性簇A和B的细胞外，所有转录簇都含有来自不同基因组簇的细胞。

Fig1. 完善治疗初期人类黑色素瘤转录组学景观

2、黑色素瘤细胞状态多样性的空间定位

为了深入了解黑色素瘤生态系统的空间组织，进行了非靶向的空间分辨转录组学。使用CellTrek将空间转录组数据与scRNA-seq数据进行整合。分析证实了在这些完整的临床样本中存在各种黑色素瘤细胞状态，包括缺氧和p53反应状态。应激（缺氧反应）细胞更靠近淋巴内皮细胞（LECs），而不是血管内皮细胞（BECs）。scRNA-seq数据建立了抗原呈递状态的恶性细胞百分比与活化的CD8+ T细胞之间的显著正相关。细胞间通讯网络的定量推断和分析预测了抗原呈递细胞状态和免疫细胞群(包括CD8+ T细胞和巨噬细胞)之间的功能相互作用，通过参与IFN II型和MHC I类和II类信号通路。邻域分析证实，在CD8+ T细胞附近富集了MHC II类标记物HLA-DR阳性的黑色素瘤细胞。HLA-DR+黑色素瘤细胞与其他免疫细胞显著共存。从空间转录组学数据推断拷贝数信息显示，在分析的所有6个转移性病变的恶性间室中，几乎没有遗传异质性。鉴于在这些病变中观察到广泛的转录组异质性，这些数据进一步证实黑色素瘤转录组景观主要由非遗传机制驱动。

Fig 2. 治疗初期黑色素瘤生态系统的空间映射

3、明确检测黑色素瘤MES细胞

具有MES表型的黑色素瘤细胞与正常间充质细胞(包括CAF)非常相似。因此，在MES细胞中表达最丰富的50个基因几乎都在CAF中表达。为了定义黑色素瘤特异性MES基因特征，列出了黑色素瘤MES细胞和CAFs之间表达差异最大的50个基因，将其称为最小谱系基因（MLGs）。这些基因中的几个，包括CDH19和S100A1，存在于超过60%的MES细胞中，它们的表达高于MITF和SOX10(两种MEL标记)，在CAFs中几乎检测不到。虽然基质基因如THY1、LUM和DCN在CAFs中的表达水平高于MES细胞，但包括转录因子TCF4(也称为ITF2或E2-2)在内的几种标记物在两种细胞类型中的表达水平相当。测量这些基因在所有黑色素瘤细胞中的表达情况发现，尽管CDH19和S100A1在所有状态下(包括MES细胞)都有表达，但TCF4等基质基因在MES细胞中有选择性表达。其他黑色素瘤亚群的MLG标记呈阳性，MES标记呈阴性。这些数据提供了在scRNA-seq数据集和组织切片中明确识别黑色素瘤MES细胞的方法，并牢固地确立了这些细胞在治疗初期人类黑色素瘤中的存在。

Fig 3. 黑色素瘤MES细胞的鉴定和原位定位

4、MES细胞富集于ICB非响应的早期治疗的黑色素瘤中

接下来研究了一个周期的ICB治疗如何重塑黑色素瘤的转录格局。在BT和OT时间点分组R和无应答(NR)患者之间，黑色素瘤细胞状态的比例没有总体差异。当将OT和BT样品结合使用时，抗原呈递和MES状态与不同的临床反应相关。虽然抗原呈递细胞状态在R样品中富集，但MES细胞在NR样品中显著富集。与NR相比，来自Rs的BT病变中的抗原呈递细胞也有增加的趋势，这在OT样品中进一步增强。配对分析显示，来自Rs和NRs的OT样品中抗原呈递和MES细胞分别有明显的增加趋势，并且这些细胞群在OT样品中的存在对反应预测显示出良好的诊断性能。为了在完整的活检中验证这些观察结果，对选定的样本进行了mIHC和上述CODEX/RNAscope方法。在T细胞扩增的患者的OT病变中，分别观察到表达MES和抗原呈递程序的细胞有显著差异。

Fig 4. 黑色素瘤MES状态与ICB应答相关

5、TCF4协调多种黑色素瘤转录程序

TCF4在黑色素瘤MES细胞中特异性表达并具有活性，它的表达与MITF呈负相关，并且在具有MES(与MEL相比)特征的癌症基因组图谱(TCGA)样本中和转移灶中(与原发病变相比)表达更高。虽然TCF4在上皮癌中是一种已知的EMT诱导剂，但在黑色素瘤中却知之甚少。由于TCF4抑制pDCs43和母细胞pDC肿瘤(BPDCN)中IFN响应基因和APM基因的表达，推断TCF4可能控制黑色素瘤MES细胞中的重叠转录网络。为了验证这一点，在具有MES表型的黑色素瘤系(MM099和MM047)中沉默TCF4，表达高水平的TCF4和不同的致癌突变(MM099的BRAFV600E和MM047的NRASQ61K)。TCF4敲低(KD)下调的基因参与细胞运动、EMT、整合素信号传导和血管生成。TCF4有助于MES表型的获得和/或维持以及对靶向治疗的耐药性。TCF4沉默也导致MITF靶点和MEL基因的上调。在TCF4 KD细胞中上调的基因中，抗原呈递和IFN信号基因特征也有很强的富集。TCF4在具有MEL表型的Ma-Mel-86细胞中过表达，通过肿瘤坏死因子α (TNF-a)阳性降低来测量，导致自体T细胞活化降低。此外，TCF4在表达卵清蛋白(OVA)的小鼠细胞系YUMM 1.7中沉默，当与OVA特异性CD8+ T细胞共培养时，通过乳酸脱氢酶(LDH)释放的增加来测量细胞损伤。在B16F10小鼠黑色素瘤细胞系中沉默TCF4，并评估IgG对照或暴露于抗pd -1的小鼠移植后的肿瘤生长情况。选择这个模型是因为它对单独抗pd -1反应不佳，而且B16F10肿瘤含有大量的TCF4-细胞。与IgG对照组相比，TCF4沉默降低了暴露于抗pd1的肿瘤的生长。组织病理学和免疫染色分析显示，暴露于ICB的TCF4 KD病变中色素沉着和免疫细胞浸润增加，退化的病变高度坏死。因此，TCF4在体内调节MEL/色素沉着特征和免疫耐受的表达。

Fig 5. TCF4协调多种黑色素瘤转录程序

6、通过BET抑制TCF4表达

TCF4表达驱动B细胞淋巴瘤和母细胞pDC肿瘤，并依赖于溴域和额外末端结构域(BET)蛋白BRD4募集到特定的TCF4增强子区域。同样，使用β降解物ARV-771抑制BRD4可降低TCF4的表达。利用测序(ATAC-seq)对转座酶可及染色质进行批量检测，结果显示BRD4结合增强子区域上游TCF4在具有MES或中间表型(如MM057)的黑色素瘤细胞中大部分可及，但在MEL细胞中不可及。该增强子也被H3K27Ac染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)峰所标记，这在MD安德森癌症中心(MDACC)队列的NR样品中比在R样品中更为明显。MM057细胞暴露于ARV-771降低了TCF4上游的染色质可及性，包括BRD4结合增强子之一。同样，这种处理导致MES细胞和MM057中TCF4表达呈剂量依赖性下降。

暴露于ARV-771重现了TCF4沉默后观察到的转录变化，包括MES基因的下调。重要的是，这种转录变化伴随着对BRAF和MEK抑制的敏感性增加。暴露于ARV-771后，MITF靶基因、抗原呈递程序和IFN信号应答基因也上调。因此，BET抑制可能是增加MES免疫原性及其对ICB敏感性的临床相容途径。

Fig 6. 通过BET抑制靶向TCF4

结论

黑色素瘤细胞具有间充质样（mesenchymal-like，MES）状态，这是一种已知对靶向治疗产生耐药性的细胞，在早期治疗活检中，对ICB无反应的黑色素瘤细胞显著富集。TCF4是MES信号的主要调控因子，也是黑素细胞和抗原呈递转录程序的抑制因子。通过基因或药物靶向TCF4，使用溴结构域抑制剂，增加MES细胞对ICB和靶向治疗的免疫原性和敏感性。因此，发现了一个依赖TCF4的调控网络，该网络协调了多个转录程序，并有助于黑色素瘤对靶向治疗和ICB的耐药性。

参考文献：

Joanna Pozniak, Dennis Pedri, Ewout Landeloos, Yannick Van Herck, Asier Antoranz, Lukas Vanwynsberghe, Ada Nowosad, Niccolò Roda, Samira Makhzami, Greet Bervoets, Lucas Ferreira Maciel, Carlos Ariel Pulido-Vicuña, Lotte Pollaris, Ruth Seurinck, Fang Zhao, Karine Flem-Karlsen, William Damsky, Limin Chen, Despoina Karagianni, Sonia Cinque, Sam Kint, Katy Vandereyken, Benjamin Rombaut, Thierry Voet, Frank Vernaillen, Wim Annaert, Diether Lambrechts, Veerle Boecxstaens, Yvan Saeys, Joost van den Oord, Francesca Bosisio, Panagiotis Karras, A. Hunter Shain, Marcus Bosenberg, Eleonora Leucci, Annette Paschen, Florian Rambow, Oliver Bechter, Jean-Christophe Marine,

A TCF4-dependent gene regulatory network confers resistance to immunotherapy in melanoma, Cell,Volume 187, Issue 1,2024,Pages 166-183.e25,ISSN 0092-8674,https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.037.

推荐阅读

齐心增效•拼搏创赢｜伯豪生物2024年会活动暨颁奖典礼圆满举办

伯豪生物首批真实样本Xenium空间原位分析实验已顺利完成！！

挑战难关，揭示生命奥秘——专为FFPE样本打造的细胞核与核酸提取试剂春节大促销！

龙重登场|植物样本单细胞核转录组测序限时大促

mRNA-seq项目文章 | 抑制NFAT5介导的星形胶质细胞肿胀可缓解神经病理性疼痛

END

本文为伯豪生物原创

欢迎转发朋友圈

转载请注明来自伯豪生物

咨询热线：17702139967

邮箱：market@shbio.com

发现“分享”和“赞”了吗，戳我看看吧

继续滑动看下一个